LITOS: uno strumento versatile di illuminazione a LED per la stimolazione optogenetica

Nov 10, 2023

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 13139 (2022) Citare questo articolo

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L'optogenetica è diventata uno strumento chiave per manipolare i processi biologici con elevata risoluzione spazio-temporale. Recentemente, sono stati sviluppati numerosi dispositivi di illuminazione multi-pozzetto commerciali e open source per fornire produttività negli esperimenti di optogenetica. Tuttavia, i dispositivi commerciali disponibili rimangono costosi e mancano di flessibilità, mentre le soluzioni open source richiedono conoscenze di programmazione e/o includono processi di assemblaggio complessi. Presentiamo uno strumento di illuminazione a LED per la stimolazione optogenetica (LITOS) basato su un circuito stampato assemblato che controlla una matrice LED 32 × 64 disponibile in commercio come sorgente di illuminazione. LITOS può essere assemblato rapidamente senza alcuna saldatura e include un'interfaccia facile da usare, accessibile tramite un sito web ospitato sul dispositivo stesso. Schemi complessi di stimolazione della luce possono essere facilmente programmati senza competenze di codifica. LITOS può essere utilizzato con diversi formati di piastre multipozzetto, piastre di Petri e fiaschetti. Abbiamo convalidato LITOS misurando l'attività della via di segnalazione MAPK/ERK in risposta a diversi regimi di stimolazione luminosa dinamica utilizzando attuatori optogenetici FGFR1 e Raf. LITOS può stimolare uniformemente tutte le cellule in un pozzo e consente schemi di stimolazione temporale flessibili. L'accessibilità economica e la facilità d'uso di LITOS mirano a democratizzare l'optogenetica in qualsiasi laboratorio.

Sebbene l'optogenetica sia stata utilizzata per la prima volta in neurobiologia1, ora è ampiamente utilizzata per controllare un'ampia varietà di processi biologici cellulari con elevata risoluzione spazio-temporale2. Ciò è stato reso possibile dalla scoperta di una serie di domini proteici sensibili alla luce che sono stati progettati per costruire attuatori in grado di controllare quasi tutti i processi biologici cellulari2. La precisione dell'optogenetica nel perturbare i sistemi cellulari può portare a una comprensione più profonda della loro regolazione dinamica3. Tuttavia, gli esperimenti optogenetici richiedono anche un appropriato hardware di stimolazione ottica.

Un apparato sperimentale optogenetico classico utilizza microscopi ottici automatizzati per stimolare le cellule che esprimono attuatori optogenetici e per registrare qualsiasi output cellulare desiderato. Se combinata con biosensori spettralmente compatibili in un microscopio a fluorescenza, questa configurazione può sia controllare l'input cellulare utilizzando l'attuatore optogenetico sia registrare la dinamica dell'output utilizzando il biosensore4. Questo si è rivelato un approccio molto potente per studiare le dinamiche di segnalazione5,6,7. Sfortunatamente, il campo visivo del sistema di lenti del microscopio limita il numero di cellule che ricevono la stimolazione luminosa. Pertanto, i microscopi non possono stimolare un numero sufficiente di cellule per misurare gli output cellulari utilizzando metodi biochimici. Inoltre, il numero di diversi modelli di stimolazione di input che possono essere indotti in parallelo è limitato. Infine, qualsiasi controllo optogenetico a lungo termine delle cellule su scale temporali di più giorni potrebbe essere poco pratico o troppo costoso, soprattutto nelle strutture di microscopia.

L'utilizzo di una sorgente di illuminazione dedicata per separare la stimolazione dal processo di imaging consente di aggirare alcune di queste limitazioni. Le strisce LED montate in un'incubatrice possono essere utilizzate per stimolare un attuatore optogenetico in un gran numero di cellule, aprendo la possibilità di misurare gli output cellulari utilizzando metodi biochimici come western blot, proteomica o trascrittomica8.

Configurazioni più avanzate combinano microcontrollori e sorgenti luminose per illuminare in modo specifico i singoli pozzetti da piastre multipozzetto. Ciò consente di stimolare più pozzi con diversi modelli di input luminosi in parallelo, con conseguente maggiore produttività sperimentale. Sono state sviluppate numerose soluzioni hardware che sfruttano i LED come fonti di illuminazione9,10,11,12. Questi dispositivi open source sono abbastanza economici ma richiedono conoscenze di programmazione e potrebbero fare affidamento su competenze di produzione non disponibili nella maggior parte dei laboratori. Recentemente sono entrati sul mercato alcuni prodotti commerciali (ad esempio LUMOS della AXION Biosystems), ma il loro costo rimane elevato. Nella comunità optogenetica manca ancora un dispositivo economico, facile da assemblare e facile da usare che offra flessibilità sperimentale.